ORAC: Su significado y correcta interpretación

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¿Qué es el ensayo ORAC? ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity, o capacidad de absorción de radicales de oxígeno) es un ensayo de laboratorio que permite cuantificar in vitro la capacidad que tiene una muestra (generalmente de un alimento) para “apagar la reactividad” que  tienen cierto tipo de radicales libres, particularmente, los del tipo peroxilo. Si bien en el ensayo ORAC dichos radicales son generados químicamente, especies reactivas que comparten cierta similitud con tales radicales serían generadas en el organismo humano, en un proceso que conduce a la oxidación masiva de diversos blancos biológicos. En el ensayo ORAC, el “apagamiento” de radicales peroxilo por parte de moléculas con actividad antioxidante presentes en las muestras analizadas se evidencia a través de la inhibición de la oxidación de una molécula blanco (fluoresceína). Dicha inhibición corresponde al aporte que colectivamente hacen a la actividad antioxidante el conjunto de moléculas con capacidad apagadora de radicales peroxilo presentes en una muestra, esto es, tanto polifenoles como otros compuestos de naturaleza no-polifenólica (como carotenos y vitaminas C y E). Esto último permite medir la actividad antioxidante de alimentos cuya composición puede ser muy diversa, en términos de la naturaleza química de las moléculas que definen sus propiedades antioxidantes. Por otra parte, el valor ORAC es función, no sólo del contenido de los polifenoles y de los compuestos no-polifenólicos presentes en una muestra (es decir, no solo de la suma de sus concentraciones), sino también de la interacción, ya sea sinérgica y/o de potenciación, que pueda existir entre tales compuestos. Cuando se da una o más de estas interacciones, la actividad ORAC resultante se refleja como una extensión del área bajo la curva que describe la oxidación de fluoresceína que va más allá de la simple suma de cada uno de sus componentes individuales (efecto aditivo). Numéricamente, el valor ORAC corresponde a aquel que se desprende del ejercicio de comparar la capacidad que tiene una determinada cantidad de muestra para apagar radicales libres con la capacidad que tiene una cantidad conocida del antioxidante estándar Trolox® (análogo hidrosoluble de la vitamina E). Diferentes concentraciones de Trolox se utilizan para construir una curva estándar, y la actividad ORAC de las muestras ensayadas se expresa como micromoles de “equivalentes Trolox» (ET) presentes en una cantidad determinada de muestra. Durante las dos últimas décadas, el ensayo ORAC ha representado la forma más comúnmente empleada para evaluar la capacidad antioxidante de alimentos ricos en tales compuestos. 

¿Cuál es la correcta interpretación de un determinado valor ORAC? Para responder a esta interrogante es preciso aclarar que el ensayo ORAC constituye sólo una forma in vitro de estimar el “potencial que tiene una muestra para apagar una determinada cantidad de radicales peroxilo”. En el caso de los alimentos, al igual que con cualquier otro ensayo de actividad antioxidante realizado in vitro (como FRAP, TEAC, CARS o DPPH), el ensayo ORAC no permite, ni intenta, hacer una afirmación categórica respecto al aporte de antioxidantes ni al impacto real que tendría dicho alimento en el organismo tras ser consumido. Esto último se debe a que, aun cuando un alimento exhiba un alto valor ORAC, el impacto antioxidante que podría finalmente suponer in vivo su consumo, independientemente del mecanismo subyacente a su acción antioxidante, dependerá de ciertas variables que claramente no se pueden anticipar en ningún ensayo in vitro, a saber, fundamentalmente: 1) de la biodisponibilidad que tendrán las moléculas antioxidantes presentes en dicho alimento (esto es, ¿qué porción de la dosis de los antioxidantes ingeridos llegará a estar finalmente disponible en la circulación general?), 2) del acceso que dichas moléculas puedan tener, tras su absorción, a los diversos tejidos y a las células donde deben encontrarse al momento de actuar (definido mayormente por el fenómeno de distribución y re-distribución entre plasma y tejidos) y, 3) de la velocidad con que éstas serán eliminadas desde el organismo (ya sea como tal o tras su previa biotransformación). Estas tres variables dependen no solo de la naturaleza química de cada una de las moléculas antioxidantes presentes en los alimentos, sino además, de las características biológicas del organismo expuesto a tales compuestos, características que a menudo podrán diferir significativamente entre un individuo y otro.  Por lo tanto, el valor ORAC solo da cuenta de la capacidad que tiene un determinado alimento para actuar in vitro como antioxidante y -obviando transitoriamente las consideraciones de absorción, distribución y biotransformación antes mencionadas-  el valor ORAC, en el mejor de los casos, podría sugerir el potencial que tendría dicho alimento para aportar antioxidantes al organismo. A pesar de las limitaciones inherentes a cualquier test in vitro, en la actualidad el ensayo ORAC sigue constituyendo el índice más empleado por la comunidad científica para estimar la actividad antioxidante de diversos alimentos. Las bases de datos de riqueza antioxidante, que junto con describir el contenido de polifenoles totales tabulan los valores ORAC de frutas y hortalizas (siendo el sitio www.portalantioxidantes.com un ejemplo de ello), son un sólido reflejo de lo anterior. A ello se suma el reconocimiento que hace la comunidad científica a través de su decisión de publicar en forma sostenida diversos trabajos en los cuales se incluye el ensayo ORAC como índice de riqueza antioxidante. Según la plataforma “Web of Sciences”, de un total de 1486 trabajos publicados durante la última década en los cuales aparece la palabra ORAC en sus abstracts, 1031 (69.4%) han sido publicados durante los últimos 5 años (datos al 30 de diciembre, 2014). 

A pesar de la continua utilidad que ha tenido el índice ORAC, su interpretación no siempre ha sido del todo correcta. Un lamentable ejemplo de esto último queda representado por la decisión de la USDA de retirar en mayo de 2012 la tabla de valores ORAC de diversos alimentos consumidos por la población norteamericana (www.ars.usda.gov/services/docs.htm?docid=15866). En nuestra opinión, dicha decisión no se debería desprender de un cuestionamiento científico del significado que el ensayo ORAC tiene en sí mismo, sino estrictamente del equivocado y a menudo irresponsable uso que ciertas personas y/o empresas interesadas en promover la venta masiva de extractos y/o suplementos ricos en antioxidantes hicieron de las tablas de valores ORAC publicadas por la USDA. Por ejemplo, desde ciertos sectores relacionados con el marketing de algunos productos nutracéuticos y de alimentos procesados, se pretendió afirmar que (a partir de las unidades ORAC tabuladas en dicha base) el aporte de las moléculas antioxidantes y, peor aún, el beneficio para la salud asociado al consumo de 100 g de una determinada fruta (como arándanos, por ejemplo) se podría lograr igualmente si se consumía un número de unidades ORAC idéntico, a través del consumo de cualesquier preparado nutracéutico en base a antioxidantes. Quien pretenda afirmar que basta con ajustar la porción de consumo de un determinado extracto rico en antioxidantes (obtenido por ejemplo, a partir de las flores, hojas o raíz de una determinada planta) para que una persona logre los mismos beneficios para la salud que aquellos que se desprenden del consumo de las mismas unidades ORAC, pero contenidas en una porción de frutas determinada (como arándanos, manzanas, almendras, u otras), no solo está profundamente equivocado, sino además comete una suerte de irresponsabilidad. Claramente, lo anterior no se puede sostener pues, entre otras razones, desatiende el hecho de que la compleja composición química (definida por la enorme variedad y concentración de las moléculas) que da cuenta de la riqueza antioxidante de un determinado alimento es propia y particular de dicho alimento. Por ello, la composición de un extracto u otro preparado cuyo origen es a menudo ajeno o lejano al del alimento natural con el que se pretende comparar, no puede ni debe suponerse idéntica. Por otra parte, aun cuando dicho extracto proviniese del mismo alimento con el cual se quiere comparar, desde un punto de vista nutricional debe tenerse en cuenta que al consumir una fruta u hortaliza determinada se está ingiriendo no solo “todos los antioxidantes que contribuyen a su alto valor ORAC”, sino además, una enorme variedad de otros componentes cuyo valor nutricional, las más de las veces, contribuye también en forma significativa a los beneficios para la salud asociados al consumo de dichos alimentos, incluyendo una diversidad de micro- y macro-minerales, fibras, ciertas vitaminas y de numerosos compuestos bioactivos (mayormente fitoquímicos). Adicionalmente, en el ejercicio de suponer que la simple equivalencia en el número de unidades ORAC permite afirmar una equivalencia en el aporte de antioxidantes al organismo, debe tenerse en cuenta la importancia que tiene la matriz de un alimento natural sobre la biodisponibilidad de sus constituyentes. En un alimento natural, las más de las veces, la biodisponibilidad de algunos de sus componentes antioxidantes se ve favorecida como resultado de una mejor absorción gastrointestinal de tales moléculas; esto último tendría lugar ya que la absorción de una determinada molécula antioxidante puede ser asistida (por diversos mecanismos) por la existencia de otras moléculas presentes en la matriz del alimento natural. En el intento de analogar –sobre la base de igualdad de unidades ORAC- el aporte de antioxidantes y a través de ello el potencial de salud que tendría un extracto rico en antioxidantes con un alimento natural del cual proviene el primero, también debe tenerse en cuenta el que los procesos de obtención de cualesquier extracto, si bien pueden ser exitosos en cuanto a incrementar la concentración de moléculas antioxidantes por unidad de masa, a menudo cambiarán la compleja composición que define la riqueza antioxidante de un alimento natural. Por ejemplo, un extracto podrá concentrar 10 o más veces la cantidad de polifenoles totales originalmente presentes en un alimento natural, pero difícilmente podrá reproducir la “huella polifenólica” presente en dicho alimento. Además, por razones propias de cada método extractivo, el proceso de concentración de antioxidantes podrá ser muy eficiente para extraer un determinado tipo de moléculas antioxidantes, pero poco eficiente para remover otras (por razones de solubilidad y/o afinidad diferencial); por ejemplo, removiendo polifenoles pero dejando en la matriz del alimento gran parte de los carotenos, del ácido ascórbico y/o de los tocoferoles presentes en la misma. Conocido es el efecto de merma de compuestos antioxidantes (termolábiles) que suponen la mayor parte de los procedimientos de secado en los cuales se aplican altas temperaturas durante la obtención de los extractos. A nuestro juicio, la no consideración de aspectos como los antes mencionados (diferencias entre in vitro e in vivo, efectos de procesamientos de alimentos y/o de obtención de extractos) refleja una suerte de sobre-simplificación del significado del valor ORAC, que ha inducido a un inadecuado uso de este índice. En el caso de la Base de datos ORAC de la USDA, a pesar de las repetidas invitaciones que hizo la comunidad científica y la propia USDA para que no se persistiera en interpretaciones equivocadas acerca del alcance de un determinado valor ORAC, ciertos agentes, quizás motivados por legítimos intereses comerciales, intentaron repetidamente analogar los beneficios para la salud asociados al consumo de 5 porciones de frutas y de verduras al día (recomendadas por la OMS) con aquellos que se desprendieron del consumo de un número idéntico de unidades ORAC a ser provistas por extractos y/o suplementos cuya supuesta distinción era la de ser “particularmente ricos en antioxidantes”. No es preciso explicar las consecuencias que tendría para la salud humana si se le indicase a la población que, tras ajustar porciones de consumo que analoguen el número de unidades ORAC, podrían sustituir el consumo de frutas y de verduras por el de ciertos volúmenes de té verde o de vino tinto ricos en antioxidantes. El consumo de estos últimos no debe ser en lugar de los primeros sino, en el mejor de los casos y habida consideración de sus ocasionales restricciones de recomendación de consumo, solo un complemento a la ingesta regular y variada de frutas y verduras, siendo hasta la fecha, el consumo de dichos alimentos la mejor opción para incorporar, junto a sus antioxidantes, un sinnúmero de otros constituyentes de alto valor nutricional. 

Lo  antes  discutido hace referencia, principalmente, a lo que no podemos asumir a partir de la información que supone un determinado valor ORAC. Entonces, ¿de qué nos sirve conocer el valor ORAC de un alimento y/o disponer de una base de datos con valores ORAC para una amplia gama de alimentos? Al conocer a través de una base de datos el valor ORAC de un alimento determinado, expresado éste como un valor numérico, esencialmente disponemos de un valor referencial  (es decir no absoluto) que, con prudencia interpretativa, nos permitirá comparar la riqueza antioxidante que dicho alimento tiene en relación a la de otro, pero estrictamente en cuanto a sus respectivas capacidades para apagar radicales peroxilo generados en un tubo de ensayo. Para hacer tal comparación, ambos alimentos tienen que haber sido analizados empleando condiciones de análisis estandarizadas. Esto es, responder a un mismo protocolo ORAC, que garantice un manejo idéntico de las muestras analizadas tanto en términos de las condiciones de disolución y/o de extracción de sus componentes antioxidantes, como de aquellas condiciones experimentales implicadas en el ensayo mismo (pH, concentración de reactantes, temperatura, agitación, lectura automatizadas de valores de fluorescencia, etc). Sin lugar a dudas, para comparar valores ORAC, estos deben estar, además, expresados en iguales unidades, por ejemplo, como micromoles de “equivalentes Trolox» (ET) por unidad de masa (generalmente 100 g) o de volumen (generalmente 100 mL) de muestra, definiéndose claramente si se trata de masa del alimento expresada en base a su peso fresco o bien a aquel estimado tras su posterior secado. Atendido lo anterior, podremos establecer rankings de actividades ORAC para una amplia variedad de alimentos (véase las Bases de Datos de Antioxidantes en Frutas: http://www.portalantioxidantes.com/base-de-datos-de-antioxidantes/ y en Hortalizas: http://www.portalantioxidantes.com/base-de-datos-de-antioxidantes-de-hortalizas/). A partir de dichos rankings, podemos afirmar que un alimento poseería una capacidad, ya sea mayor o menor para “apagar radicales peroxilo” relativo a otro, entendiendo estrictamente que tal diferencia se refiere a una comparación de capacidades que han sido evaluadas bajo condiciones in vitro y estandarizadas del ensayo ORAC. 

Por otra parte, dependiendo de si la base de datos ofrece, además de valores ORAC, otros parámetros antioxidantes, como son el contenido de polifenoles, de flavonoides y/o de antocianos totales (resultados que deben emerger de mediciones en la misma muestra analizada), se podrá intentar establecer correlaciones entre los valores ORAC obtenidos y dichos parámetros. A partir de tales correlaciones, se podría estimar la posible contribución que estarían haciendo a una mayor actividad ORAC algunos de los antioxidantes antes mencionados. Por ejemplo, una alta correlación directa entre valores ORAC y contenido de polifenoles totales (PFT) sugiere que muy posiblemente, a un mayor valor del primero subyace un valor proporcionalmente mayor del segundo, ya que los polifenoles estarían contribuyendo en forma significativa al valor ORAC. Contrariamente, una muy baja correlación entre tales parámetros sugeriría que en ciertos alimentos su contribución es solo secundaria, existiendo la posibilidad de que otros componentes no polifenólicos, capaces de atrapar radicales peroxilo, estén contribuyendo en forma significativa a un mayor valor ORAC. 

Junto a la posibilidad de comparar alimentos naturales en términos de sus valores ORAC, la existencia de bases de datos de riqueza antioxidante de distintos alimentos permite estimar, a través de estudios epidemiológicos, la posible existencia de correlaciones entre la ingesta teórica de antioxidantes presentes en los alimentos consumidos por una población (estimada, por ejemplo, como la suma de unidades ORAC, del contenido de polifenoles totales o bien de algún polifenol en particular) y el riesgo relativo de desarrollo y/o prevalencia de diversas patologías. 

La importancia de medir el contenido de polifenoles totales al momento de construir una base de datos de riqueza antioxidante en la que se incluyen valores ORAC en los alimentos, se desprende del hecho de que todos los polifenoles (flavonoides y no-flavonoides) poseen propiedades antioxidantes (incluyendo la capacidad de apagar radicales peroxilo), y de que por su relativa abundancia, dichos compuestos son los que más contribuyen al valor ORAC de alimentos. Sin embargo, durante la última década se ha reconocido que algunos polifenoles exhiben, además, bioactividades que podrían contribuir significativamente a muchos de los beneficios a la salud que tradicionalmente han estado asociados a su función antioxidante. Entre tales bioactividades se incluyen, por ejemplo, acciones vasodilatadoras, antiagregantes plaquetarias, anti-inflamatorias y normo-reguladoras tanto de la glicemia como del perfil lipídico. Por lo tanto, debe tenerse presente la posibilidad de que un alimento, a pesar de exhibir un valor ORAC y/o contenido polifenólico relativamente bajo, pueda exhibir una concentración relativamente alta de un polifenol en particular (y no de otros) cuya bioactividad principal se encuentre entre las antes mencionadas, y que por ende su consumo bajo la forma de dicho alimento podría bien suponer un significativo beneficio para la salud humana, al actuar por mecanismos no necesariamente antioxidantes. De esto último se desprende la importancia fundamental que tienen iniciativas como la del INRA-Francia, que han permitido contar con una base de datos que actualmente da cuenta del contenido (individual) de más de 500 diferentes polifenoles para un total de aproximadamente 400 alimentos http://phenol-explorer.eu/ 

Sin perjuicio del potencial beneficio para la salud que puede suponer el que además de sus propiedades antioxidantes, algunos polifenoles exhiban otras bioactividades, cabe notar que una parte creciente de las investigaciones más recientes en torno a las propiedades antioxidantes de los polifenoles se ha centrado en mecanismos de acción que no-necesariamente residen en la habilidad de estos compuestos para apagar radicales libres. Por ejemplo, un número no menor de polifenoles ha sido ampliamente estudiado en cuanto a su capacidad para: 1) prevenir la formación de radicales libres y de otros ROS, al inhibir la síntesis y/o la actividad de enzimas pro-oxidantes (como NADPH-oxidasa, xantina oxidasa o mieloperoxidasa) y/o al quelar metales redox-activos (como hierro o cobre), 2) favorecer la remoción de ROS, al inducir la síntesis y/o la actividad de enzimas antioxidantes (como SOD, catalasa y glutatión peroxidasa) y/o, 3) incrementar la síntesis o la regeneración de antioxidantes endógenos al inducir la síntesis de las enzimas correspondientes (como gama-glutamil-sintetasa y glutatión reductasa). Un importante mecanismo que contribuye a aumentar la expresión de genes que codifican para la síntesis de enzimas antioxidantes es el que implica la habilidad de ciertos compuestos para liberar el factor nuclear eritroide 2 (NRf2) desde el complejo que forma este con la proteína KEAP1. Cabe destacar que ciertos polifenoles son extremadamente potentes en promover tal proceso en concentraciones relevantes a aquellas que se alcanzan in vivo, permitiendo la translocación del factor transcripcional  NRf2 al núcleo y su posterior unión a regiones ARE (Antioxidant Responsive Elements) del ADN. Tal habilidad no es, en absoluto, detectada ni menos cuantificada por el ensayo ORAC (ciertamente tampoco lo es por ninguno de los otros ensayos in vitro arriba mencionados). Por tanto, debe tenerse presente que un alimento que presenta un bajo valor ORAC (y presumiblemente un bajo contenido de PFT) no necesariamente es un alimento con un bajo potencial para favorecer una acción antioxidante. En efecto, en este último caso, el alimento bien podría ser particularmente rico en uno o más de aquellos polifenoles para los cuales se ha demostrado que aun en bajas concentraciones, son capaces de modular favorablemente mecanismos antioxidantes indirectos, es decir, independientes del apagamiento de ROS, y que en forma amplificada podrían contribuir a reducir el estrés oxidativo que caracteriza la mayor parte de aquellas patologías que en la actualidad más afectan a la población (cardiovasculares y tumorales). 

Conclusiones: Respecto al ensayo ORAC podemos concluir que se trata de una metodología que permite medir bajo condiciones in vitro la capacidad que tiene una muestra de alimento para apagar radicales peroxilo. Este ensayo recoge la suma de la contribución de “todas las moléculas que en un alimento dado pueden contribuir a apagar dicho radicales”, y por ende entrega una estimación global de la riqueza antioxidante del alimento, contrastando con el más limitado alcance interpretativo que supone la sola medición de un componente antioxidante en particular. Sin embargo, el ensayo ORAC, al igual que todos los ensayos in vitro, no contempla aquellas variables que tras la ingesta de un alimento entran en juego para definir la absorción, distribución y eliminación de aquellos compuestos que in vitro han dado lugar al valor ORAC. Por lo tanto, a partir de un valor ORAC determinado no es posible afirmar cuál sería el impacto in vivo que realmente tendrá el consumo de dicho alimento sobre la capacidad antioxidante del organismo ni sobre la salud humana. No obstante, disponer de Bases de datos con valores ORAC ofrece la oportunidad de establecer rankings y comparaciones de riqueza antioxidante para una gran gama de alimentos naturales. Asimismo, permite estimar correlaciones con otros parámetros antioxidantes y eventualmente, a través de estudios epidemiológicos estimar, en base a información de consumo de alimentos, posibles correlatos con el riesgo relativo de desarrollo y/o de incidencia de diversas patologías. En el afán de caracterizar la riqueza antioxidante de un alimento, entender el verdadero alcance interpretativo que supone el ensayo ORAC es fundamental para evitar su equivocado o abusivo uso. La actual utilidad del ensayo ORAC queda plenamente evidenciada por la constante aparición de nuevas bases de datos en torno a la actividad ORAC de los alimentos, así como por el sostenido y creciente uso de esta metodología que viene haciendo la comunidad científica. 

 

Hernán Speisky C; PhD. Profesor Titular, Laboratorio de Antioxidantes, INTA, Universidad de Chile

Camilo Lopez-Alarcón; PhD. Prof. Asoc. Facultad de Química, Pont. Universidad Católica de Chile

Jocelyn Fuentes G; Q.I., PhD. Jefa de Laboratorio de Análisis de Antioxidantes (LAOX), INTA, Universidad de Chile

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