ANÁLISIS DE ANTIOXIDANTES: QUÉ Y CÓMO SE DEBE MEDIR?

El amplio reconocimiento científico de que un mayor consumo de alimentos ricos en antioxidantes redunda en claros beneficios para la salud de la población ha llevado a que los consumidores se interesen cada vez más en conocer ¿cuál es efectivamente la riqueza antioxidante de los productos que el mercado les ofrece?

Si bien hasta hace poco la sola mención del término “antioxidante”, sea a través de una campaña de promoción o impreso en el envase de un producto, era suficientemente atrayente para que los consumidores se inclinen por dicho producto, recientemente, y en forma creciente, los consumidores buscan distinguir entre aquellos productos cuyo marketing “simplemente reclama tener antioxidantes”… y aquellos en los cuales “el contenido de estos compuestos es debidamente sustentado por informes de análisis y/o cuantitativamente descrito en su rotulación”.

En el marco de lo anteriormente mencionado, en la presente sección se aborda, entre otras, interrogantes como las siguientes: ¿Qué Antioxidantes deben medirse en un Alimento?, ¿Cuáles son los principales ensayos y métodos analíticos disponibles para su medición?, ¿Por qué es importante medir y rotular el contenido de polifenoles y el valor ORAC en los Alimentos? ¿Qué diferencia existe entre medir y certificar el contenido y la actividad antioxidante de un alimento?

Para enfrentar la interrogante ¿Qué Antioxidantes deben medirse en un Alimento?, es preciso responder previamente a lo siguiente:

¿Cuáles son los principales antioxidantes presentes en los alimentos? La riqueza antioxidante de los alimentos está generalmente dada por la suma e interacción de numerosas moléculas. Si bien la estructura química de tales moléculas puede ser significativamente diferente, entre los principales antioxidantes presentes en los alimentos es posible distinguir:

i) Las Vitaminas antioxidantes, que comprende el Ácido ascórbico (o Vitamina C); la Vitamina E, un término que incluye no solo al alfa–tocoferol, sino además, a las isoformas, alfa, beta, gama y delta,  de los tocoferoles y los tocotrienoles; y los compuestos Pro-Vitamina A  (representados por el beta-caroteno, el alfa-caroteno y la beta- criptoxantina).

ii) Los Carotenoides, entre los cuales destacan la luteína, el licopeno, la zeaxantina y la astaxantina. Bajo la denominación de carotenoides se incluyen también aquellos compuestos que son Pro-Vitamina A (arriba mencionados). Desde un punto de vista químico, los carotenoides comprenden los carotenos (alfa-caroteno, beta-caroteno y licopeno), que no incluyen átomos de oxígeno en su estructura, y las xantofilas (beta-criptoxantina, luteína, astaxantina y zeaxantina), que sí lo presentan, mayormente bajo la forma de  hidroxilos. Cuando no es posible medir cada uno de los carotenoides mencionados, se recomienda la medición de la suma del contenido de dichos compuestos (Carotenoides Totales). 

iii) Los Polifenoles. Los polifenoles dan cuenta de la riqueza antioxidante de la parte mayor de los alimentos habitualmente consumidos por la población. Todos los polifenoles exhiben en su estructura uno o más grupos hidroxílos unidos a un anillo aromático. Entre los polifenoles es posible distinguir dos tipos mayores de compuestos: los flavonoides, para los cuales se han descrito varios miles en el reino vegetal y cuya estructura comprende dos anillos aromáticos unidos un heterociclo de tres átomos de carbono y uno de oxígeno (C6-C3-C6), y los llamados no-flavonoides (algunos cientos) que comprenden, mayormente, alcoholes mono-fenólicos, ácidos fenólicos y estilbenos. Si bien conocer el contenido específico de cada polifenol presente en un alimento, limitaciones de costos y/o analíticas hacen a menudo difícil su determinación. Una alternativa es limitar la determinación analítica a solo uno o algunos de los polifenoles más importantes del mismo. Un ejemplo de esto es la frecuente medición que se hace del contenido de ácido hidroxitirosol y de la oleuropeína en muestras de aceites de oliva, en olivas, y/o en descartes asociados a la producción de dichos aceites. Sin embargo, independientemente de lo anterior, cuando se trata de establecer la riqueza antioxidante de una muestra de alimento que contiene polifenoles, siempre se debe realizar la medición del contenido total de estos compuestos (Polifenoles Totales). 

Cabe destacar que dentro de la subclase flavonoides existen los antocianos, un grupo de compuestos que le imprimen coloración a diversas frutas (como son todos los berries incluyendo arándanos, calafate, maqui, frambuesas, frutillas, moras, uvas, ciruelas) y verduras (como son ciertas lechugas, betarragas, papas, zanahorias y cebollas). Dependiendo de si están o no conjugados con azúcares, los antocianos se denominan antocianinas cuando sí lo están, y antocianidinas cuando se encuentran como agliconas. En consideración a lo anterior, en las evaluaciones de la riqueza antioxidante de alimentos coloreados se recomienda siempre medir el contenido total de antocianos (Antocianos Totales), junto a otros indicadores de riqueza antioxidante. 

Detallada información respecto a cuál es la composición antioxidante de los principales alimentos ingeridos por la población, se encuentra la sección “Antioxidantes en alimentos: Principales fuentes y sus contenidos”.

Ahora bien, conociendo cuales son los tipos de antioxidantes que más predominan en un determinado alimento, es posible volver a la interrogante de ¿Que antioxidantes deben medirse en un alimento? Aunque la respuesta a esta interrogante está sujeta a la naturaleza del alimento a analizar, en términos generales será posible medir en los alimentos:

(I) el contenido específico de aquellos antioxidantes que dicho alimento más concentra, o la de aquellos cuya presencia es más relevante para su distinción como fuente o aporte de dicho compuesto; por ejemplo, el contenido de ácido ascórbico, el de alfa-tocoferol, el de licopeno, o el de algún flavonoide en particular;

(II) el contenido total de un determinado tipo de antioxidante, por ejemplo, el contenido total de polifenoles o el contenido total de antocianos presentes en un alimento;

(III) la actividad antioxidante del alimento.  A diferencia de la sola medición del contenido de un antioxidante determinado, la medición de la “actividad antioxidante” de un alimento permite cuantificar la “capacidad que tendrían todos los compuestos antioxidantes presentes en éste” (vitaminas + carotenoides + polifenoles + otros que no responden a las categorías anteriores) para actuar simultáneamente como una mezcla de compuestos antioxidantes.

Pero entonces, ¿Qué debe medirse?

Si se pretende realizar una caracterización de un alimento desde el punto de vista de su riqueza antioxidante, idealmente se debería cuantificar el contenido individual de cada uno de aquellos antioxidantes que a priori se sabe que dicho alimento contiene, y se debería medir la actividad antioxidante que -como resultado de la suma e interacción de sus componentes antioxidantes- dicho alimento presenta.

Sin embargo, el propósito de medir en forma individual el contenido de cada uno de los componentes antioxidantes de un alimento puede resultar algo costoso y analíticamente más complejo, dado que en aquellos alimentos que son más ricos en antioxidantes, estos compuestos comprenden, regularmente, un gran número y una enorme diversidad de estructuras.

¿Qué alternativa existe a la medición del contenido individual de cada uno de los componentes antioxidantes de un alimento? Como alternativa a la medición individual, se puede cuantificar el contenido total que presenta un alimento en términos de un tipo determinado de antioxidantes. Por ejemplo, cuando la riqueza antioxidante de un alimento reside mayormente en una alta presencia de polifenoles, la medición se acota a la caracterización del contenido antioxidante bajo la forma de polifenoles totales (PFT). Si se precisa, junto a la medición de PFT es posible medir, en forma más precisa, el contenido de flavonoides totales, y aún más específica, el contenido de determinados subtipos de flavonoides, como serían las antocianidinas totales, los flavonoles totales o los flavan-3-oles totales.  Mayores detalles respecto a la química y presencia de estos compuestos en los alimentos se describe en la sección “Antioxidantes en alimentos: Principales fuentes y sus contenidos”.

¿Cómo se determina el contenido de polifenoles totales? El contenido de PFT es determinado a través de un ensayo que emplea el reactivo de Folin-Ciocalteu (F-C). Todos los métodos hasta ahora publicados que emplean dicho reactivo miden la capacidad que tienen los polifenoles para reducir (donar un electrón) el Mo(VI) a Mo(V) presente en el complejo molibdotungstato que caracteriza el reactivo de F-C. Como resultado de tal reducción, el reactivo, de color amarillo, adquiere un intenso color azul, el cual es cuantificado espectrofotometricamente a 765 nm. Si bien todos los métodos disponibles que emplean el reactivo de F-C aseguran la oxidación total de todos aquellos compuestos capaces de reducirlo, éstos difieren en cuanto a las concentraciones de dicho reactivo empleadas, al tipo de base y concentración empleada para alcalinizar el medio (carbonato versus hidróxido de sodio), a los tiempos de incubación necesarios para hacer cuantitativa la reducción del reactivo (3-120 min), y las temperaturas de incubación de las muestras durante su análisis (20-50 ºC).

¿Cómo se expresa el contenido de polifenoles totales de una muestra? El contenido de PFT resultante de la aplicación de cualquier método que se base en el uso del reactivo de Folin-Ciocalteu es regularmente expresado como mg de equivalentes de ácido gálico (EAG)/100 g de alimento. El ácido gálico es un compuesto fenólico simple ampliamente empleado en este ensayo como estándar de comparación. Sin embargo, ocasionalmente se solicita emplear también como estándar de comparación y expresión de resultados polifenoles como catequina o los ácidos tánico, clorogénico, caféico, vanílico y ferúlico.

Para encontrar un listado completo de los valores de contenido de PFT en frutas producidas y/o consumidas en Chile, visite nuestra sección “Base de Datos de Antioxidantes en Frutas”. Del mismo modo, para encontrar un listado completo de los valores de contenido de PFT en verduras (incluidas en hortalizas) producidas y/o consumidas en Chile, visite nuestra sección “Base de Datos de Antioxidantes en Hortalizas”.

¿Son los métodos que emplean el reactivo de Folin-Ciocalteu específicos para la determinación de polifenoles? Tal como se mencionó anteriormente, en el ensayo de Folin-Ciocalteu se mide la capacidad que tienen los polifenoles para actuar como reductores de Mo(VI) en el complejo molibdotungstato. Si bien el ensayo de reducción del reactivo es simple, sensible y preciso, debe señalarse que dicho reactivo es susceptible de ser reducido no solo por todos los polifenoles, sino también por reductores como ácido ascórbico, metabisulfito de sodio, sales de hierro(II), EDTA, ciertos aminoácidos, fructosa y glucosa, entre otros. Esto último es extremadamente importante ya que cuando se aplica este método a muestras que contengan uno o más de dichos interferentes, sin tomar las medidas correctivas, se obtendrá equivocadamente un resultado que representa una sobre-estimación del valor real de polifenoles totales.

Como resultado del efecto interferentes que tendrían compuestos como fructosa, glucosa o ácido ascórbico, normalmente presentes en frutas, verduras, y en numerosos alimentos procesados,  es de importancia que, en la aplicación de cualquier método que emplea el reactivo de F-C, se tenga presente la incorporación de controles adecuados, idealmente, empleando modificaciones al método original que permitan discriminar analíticamente entre la contribución que hacen a la reducción del dicho reactivo  los polifenoles que se desea medir y aquellos componentes “interferentes” no-polifenólicos presentes en una muestra.

¿Que limitaciones de interpretación supone la sola medición de PFT en la caracterización de la riqueza antioxidante de un alimento? Si bien la medición de PFT es ampliamente empleada y reconocida como una forma preliminar de caracterizar la riqueza antioxidante de un alimento, debe tenerse presente que, como tal, la medición de PFT no distingue la medida ni la proporción en que los diversos subtipos de polifenoles presentes en un alimento están individualmente contribuyendo al contenido polifenólico total. Dicho ensayo tampoco evalúa el valor que tendría la interacción entre los distintos polifenoles presentes en un alimento.

No obstante, la medición de PFT, cuando es debidamente realizada (esto es con corrección de interferentes) constituye una aproximación muy buena, simple y práctica al propósito de caracterizar inicialmente a un alimento en términos de su contenido antioxidante, especialmente cuando se trata de aquellos en los cuales los polifenoles dan mayormente cuenta de su composición antioxidante.  Sin embargo, cuando los polifenoles solo dan cuenta en forma parcial de la riqueza antioxidante de un alimento, la sola medición de los PFT como una forma de evidenciar tal riqueza podría suponer una subestimación proporcional a la contribución que hacen compuestos de naturaleza no-polifenólica a la riqueza antioxidante total del alimento analizado.

Para evitar tal subestimación, y dado que muchos alimentos ricos en antioxidantes poseen no sólo compuestos fenólicos, sino también antioxidantes de naturaleza no-fenólica (ej. diversas vitaminas antioxidantes y carotenoides), es muy importante que la caracterización de la riqueza antioxidante de los alimentos comprenda, además, la medición de su “actividad antioxidante”.

Pero, realmente ¿Qué se mide cuando se determina la actividad antioxidante de un alimento? Lo primero a destacar es que la medición de la actividad antioxidante de un alimento supone la cuantificación de “virtualmente” todas las moléculas antioxidantes presentes en este.

La mayor parte de los ensayos empleados para la determinación de la actividad antioxidante de un alimento se basan en la medición de: (1) la capacidad que tienen los compuestos antioxidantes para reaccionar con un radical libre o ROS determinado, o  (2) el potencial que tales compuestos tendrían para reducir un complejo formado entre iones Fe(III) y el reactivo TPTZ (2,4,6-tripiridil-s-triazina).

Entre aquellos ensayos que se basan en la medición de la capacidad de los antioxidantes para reaccionar con un radical libre, cabe destacar los siguientes:

– Ensayo ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity, o Capacidad de       Absorción de Radicales de Oxígeno)

– Ensayo TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity, o Capacidad         Antioxidante como Equivalentes Trolox)

– Ensayo DPPH (2,2-Difenil-1-picrilhidrazil).

Existe consenso que para caracterizar la actividad antioxidante de un alimento, el ensayo ORAC destaca entre todos los ensayos disponibles por su alta sensibilidad, precisión y reproducibilidad.

¿Qué es el ensayo ORAC?

A diferencia de la simple medición del contenido de los antioxidantes presentes en un alimento, el ensayo ORAC mide la actividad o capacidad global que tienen todos los antioxidantes presentes en una muestra para “apagar o neutralizar” (scavenging) radicales primariamente peroxilo.

Estos últimos son especies reactivas comparables y por tanto relevantes a aquellos ROS biológicamente generados en el organismo. En el ensayo ORAC, los radicales peroxilo (y en menor grado los alcohoxilo), generados a partir del azo-compuesto AAPH o ABAP ([2,2?-azobis(2-amidinopropano]), reaccionan con fluoresceína como sustrato. Como resultado de tal reacción, la fluorescencia de este último compuesto decrece a través del tiempo, configurando un área bajo la curva (fluorescencia versus tiempo). Cuando dicha reacción tiene lugar  en presencia de compuestos antioxidantes, el área bajo la curva se incrementa en forma lineal y proporcional a la concentración de antioxidantes.

Para actuar como tal, los antioxidantes deben, donar ya sea un electrón (SET), o un átomo de hidrógeno a los mismos (HAT) los radicales libres que se pretende estabilizar.  El ensayo ORAC mide la capacidad que tienen todos los antioxidantes presentes en un alimento (o muestra de este) para donar átomos de hidrógeno a los radicales peroxilo. Por ende, el método ORAC cuantifica la capacidad que tendría un alimento para actuar como antioxidante a través del mecanismo HAT.

El ensayo ORAC comprende la medición del aporte que hacen a la actividad antioxidante tanto los polifenoles como aquellos compuestos de naturaleza no-polifenólica presentes en un alimento dado, y por tanto permite comparar la actividad antioxidante, valor ORAC, de alimentos que no necesariamente tienen polifenoles como sus principales componentes con aquellos que sí lo tienen. Por ejemplo, es posible comparar el valor ORAC de un tomate (rico en licopeno pero pobre en polifenoles) con el de una manzana (que es rica en polifenoles pero no contiene licopeno).

El ensayo ORAC no sólo refleja el contenido total de los compuestos antioxidantes, sino también, la interacción aditiva, sinérgica o de potenciación que resulta de la simultánea presencia de estos, dando como resultado un valor que refleja la capacidad global o actividad antioxidante de un alimento.

¿Cómo se expresa el valor ORAC de una muestra? El valor ORAC se expresa como micromoles de equivalentes Trolox®/100 g de muestra. El Trolox® es un análogo de la vitamina E que, por su fácil solubilidad en agua es empleado como estándar de comparación.

Dado que el método ORAC permite comparar alimentos de naturaleza muy diversa en cuanto a su riqueza antioxidante, el ensayo ORAC representa en la actualidad la forma más empleada de evaluar la actividad antioxidante de alimentos. Como tal, el valor ORAC constituye el índice más reconocido al momento de definir el potencial aporte que podría suponer el consumo de un alimento a la capacidad antioxidante de nuestro organismo.

Si bien la confianza que se tiene en torno a los valores de actividad antioxidante generados a través del empleo del método ORAC se desprende, en gran medida, de la alta sensibilidad, precisión y reproducibilidad del método, es claro que para asegurar tales características el ensayo debe ser ejecutado por un laboratorio que esté dotado no sólo de una instrumentación adecuada que permita su automatización, sino que además, que vele por el cumplimiento del protocolo analítico estandarizado del método.

Para encontrar un listado completo de los valores ORAC en frutas producidas y/o consumidas en Chile, visite nuestra sección “Base de Datos de Antioxidantes en Frutas”. Del mismo modo, para encontrar un listado completo de los valores ORAC en verduras (incluidas en hortalizas) producidas y/o consumidas en Chile, visite nuestra sección “Base de Datos de Antioxidantes en Hortalizas”.

¿En qué difiere el método ORAC de otros métodos de determinación de la actividad antioxidante? Si bien otros métodos, como el TEAC y el DPPH evalúan también la capacidad de los antioxidantes de una muestra para “apagar o neutralizar” un radical libre, tanto el TEAC como el DPPH emplean como radicales libres moléculas que difiere totalmente de cualquier radical libre o especie reactiva generada por nuestro organismo. Mientras en el primer caso se emplea el catión radical ABTS•+, en el segundo se emplea el radical DPPH•. Si bien la alta estabilidad de ambos radicales hace más simple su empleo, la misma condición sitúa a los métodos TEAC y DPPH como aproximaciones analíticas muy distantes de la alta reactividad que típicamente caracteriza a los ROS normalmente generados en sistemas biológicos. Por tanto, la relevancia de estos métodos es frecuentemente cuestionada. Ambos métodos suelen ser útiles para realizar un “ranking de compuestos/preparados antioxidantes” dentro de un “batch”, un experimento o un estudio determinado, pero, más allá de su simpleza técnica, la relativamente baja sensibilidad y reproducibilidad de ambos métodos limita la posibilidad deseable de comparar los valores TEAC o DPPH.

¿Puede una igualdad de valores ORAC entre dos alimentos distintos suponer igual valor nutricional? Es fundamental aclarar que una eventual igualdad en el valor ORAC entre un alimento y otro (sean éstos de igual naturaleza o no), no necesariamente significa igualdad en el valor nutricional de ambos. En efecto, este último estará dado por la presencia (contenido y tipo) de numerosos nutrientes, entre otros, proteínas, lípidos, carbohidratos, vitaminas, y micro/macrominerales. 

De modo similar, una igualdad en la actividad antioxidante tampoco permitiría suponer una equivalencia en el potencial beneficio que por concepto de ingesta de los antioxidantes presentes en dichos alimentos, tendría para la salud humana el consumo indistinto de estos. Como se describe en la sección “Antioxidantes y salud: Evidencias científicas”, si bien todos los polifenoles comparten su capacidad para actuar como antioxidantes, la existencia de aún pequeñas diferencias en sus estructuras suele, a menudo, resultar en significativas diferencias tanto en la biodisponibilidad (absorción y posterior disponibilidad de éstos en la sangre) como en el perfil de acción biológica de dichos compuestos (ya que éstos actúan no sólo como atrapadores de radicales libres).

¿Por qué es importante medir y rotular el contenido de polifenoles y el valor ORAC en los Alimentos?

En nuestro país, advertidos de la excelente disposición que los consumidores también tienen para optar por productos en los cuales se destaca la presencia de antioxidantes, diversas empresas promueven activamente el consumo de productos que, aunque no certifican su contenido y actividad antioxidante, los rotulan como “ricos en antioxidantes”. Ejemplos de esto último son ciertas marcas de té, de café y de cervezas que reclaman ser “naturalmente ricas en antioxidantes”, así como ciertas marcas de aguas minerales y otras bebidas que, tras la adición de antioxidantes a su formulación, son también generalmente promocionadas como “bebidas con antioxidantes”. De acuerdo a la opinión de expertos en el área de antioxidantes, para seguir avanzando con seriedad en la promoción del consumo de alimentos ricos en antioxidantes, es esencial distinguir entre aquellos productos cuyo marketing “simplemente reclama tener antioxidantes…” y aquellos en los cuales “el contenido de estos es sustentado por informes de análisis y cuantitativamente descrito en su rotulación”. Crecientemente, ciertos actores de la industria nacional han tomado conciencia de esto último, avalando a través de informes de análisis independientes el contenido y actividad antioxidante de sus productos. Para tener plena seguridad acerca de la real y continua presencia de un valor de polifenoles totales y de ORAC en un producto determinado, es fundamental que éste cuente con el respaldo que supone su análisis regular y/o certificación.

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